緩沖液的使用

更新時(shí)間：2014-02-28 點(diǎn)擊次數(shù)：1284次

上海橋星生物

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    生物化學(xué)主要是研究生物大分子及其相互作用的科學(xué)，而生物大分子是存在于生物的基本單元—細(xì)胞、細(xì)胞間液或體液中的。生物大分子在活細(xì)胞內(nèi)的特定存在條件（pH、離子強(qiáng)度及其他生物大分子的相互制約）下，不僅能保持其結(jié)構(gòu)的完整而且能保持一定的生物活力。研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，至今尚未找到一種在細(xì)胞內(nèi)即可進(jìn)行的方法。因此，人類若想研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，從而在分子水平上闡述生命現(xiàn)象的本質(zhì)，就必須先把生物大分子從細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)完整、純凈且保持其活力地分離出來(lái)。因此，當(dāng)我們將組織或細(xì)胞破碎并在體外（in vitro）分離純化和研究其生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，就必須時(shí)刻注意保持其結(jié)構(gòu)的完整性并維持活力！若想做到這一點(diǎn)，我們就必需從細(xì)胞破碎開(kāi)始（生物大分子馬上失去了其賴以保持活力的制約條件），時(shí)刻注意為這些“離體”的生物大分子提供保持結(jié)構(gòu)完整，維持其活力的環(huán)境條件。
    這種條件不是水、去離子水等能提供的。也就是說(shuō)，我們要為生物大分子提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定而適宜的pH環(huán)境、合適的離子強(qiáng)度及其他外界條件。同樣的，在組織和細(xì)胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)等細(xì)胞生物學(xué)，組織和病理學(xué)以及許多生命科學(xué)研究的體外培養(yǎng)和體外實(shí)驗(yàn)中，也需要模擬器官、組織和細(xì)胞等的生理環(huán)境以維持其基本的代謝和生物特性或生命特征。毫無(wú)疑問(wèn)的，在所有這些實(shí)驗(yàn)中，所用液體的基礎(chǔ)溶液都是緩沖液。
    緩沖液是溶液中維持溶液pH相對(duì)穩(wěn)定，能“中和”外加酸或堿的化學(xué)成分。一般來(lái)說(shuō)，緩沖液是弱酸及其共軛堿（如乙酸和乙酸納）或弱堿及其共軛酸（如氨和氯化銨）組成的溶液，其中的弱酸及其共軛堿或弱堿及其共軛酸則稱緩沖對(duì)。
    選擇緩沖液的依據(jù)是它的pKa值及其化學(xué)性質(zhì)。緩沖液在pH=pKa±1的范圍內(nèi)是zui有效的。超出這個(gè)范圍，無(wú)論是還是堿濃度都太小，不能有效抵抗外加酸或堿的影響。而溶液緩沖能力的大小，則取決于緩沖對(duì)兩個(gè)組分的濃度。選用緩沖液時(shí)，還應(yīng)考慮緩沖液總的離子強(qiáng)度。由于溫度可影響某些弱酸和弱堿的解離，因此也影響pH值。所以配制緩沖液時(shí)務(wù)必要考慮環(huán)境溫度變化對(duì)緩沖液pH的影響。
    在生命科學(xué)研究中，緩沖液的化學(xué)性質(zhì)特別重要。選用緩沖液時(shí)不僅要考慮緩沖對(duì)的溶解度、穩(wěn)定性，還要考慮與系統(tǒng)中其它離子或化學(xué)成分的相互作用，以及光吸收和對(duì)生物系統(tǒng)功能的潛在抑制作用或刺激作用。
使用緩沖液時(shí)應(yīng)注意的一些事項(xiàng)
    1.向緩沖液中添加一些必要的穩(wěn)定劑（如巰基保護(hù)劑——乙醇、多元醇、甘油、蔗糖、乙二醇、DDT等），以保護(hù)生物大分子重要的活性基團(tuán)或空間結(jié)構(gòu)。
    2.添加金屬離子或絡(luò)合劑，以保護(hù)對(duì)金屬離子敏感（需要或不需要）的生物大分子。有些酶需要兩價(jià)的金屬離子（如Ca++,Mg++,Mn++等）作為其輔因子；有些生物大分子則要時(shí)刻防范上述酶類（如DNase，Nuclease等）對(duì)它們的降解，故要向緩沖液中添加EDTA或EGTA等螯合劑，以保護(hù)它們不被降解。
    3.添加蛋白酶抑制劑。如我們要研究蛋白質(zhì)分子，在分離純化他們的過(guò)程中，必須時(shí)刻防止他們被蛋白酶所水解。為此可向緩沖液中添加PMSF（苯甲基磺酰氟）或DFP（磷酸二異丙基氟），亮抑肽等。它們可分別抑制哺乳動(dòng)物蛋白酶或絲氨酸蛋白酶的活力。
    4.蛋白質(zhì)添加劑：生物大分子需要有一定的濃度，才能保持其完整的空間構(gòu)像。因此，經(jīng)過(guò)一系列分離純化步驟而zui終得到純酶制品時(shí)，有時(shí)其濃度很低。為保持這類濃度很稀的純酶的活力，往往要向這類酶制品（特別是一些商售的限制性核酸內(nèi)切酶）中人為地添加一些蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白（Casein）等，從而既保護(hù)了目的酶的空間構(gòu)象又不影響其活力。
    5.滲投壓：在組織和細(xì)胞的體外培養(yǎng)、保存或洗滌等實(shí)驗(yàn)中，除了溶液的酸堿度，營(yíng)養(yǎng)成分和與其它離子或化學(xué)成分的相互作用外，還要注意液體的滲投壓。低滲可導(dǎo)致溶血或細(xì)胞膜破裂，高滲引起細(xì)胞皺縮或抑制細(xì)胞代謝。有的緩沖對(duì)濃度稍高，即可因其與其它離子或化學(xué)成分相互作用而影響溶液的穩(wěn)定性或?qū)?xì)胞的功能產(chǎn)生副作用，因此，為了不使某一緩沖對(duì)的濃度過(guò)高，可以在同一個(gè)溶液中添加多個(gè)不同的緩沖系統(tǒng)；為了保持溶液處于等滲狀態(tài)，避免高滲或低滲的出現(xiàn)，常通過(guò)添加氯化鈉等中性鹽的方法調(diào)整溶液的滲投壓，如在磷酸緩沖液（PB）中添加氯化鈉配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)。